生化檢測(cè)的本質(zhì)就是某物質(zhì)化學(xué)變化的顯色反應(yīng)，其反應(yīng)過程可以劃分為四個(gè)區(qū)：延遲區(qū)、等速區(qū)、過渡區(qū)和平衡區(qū)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖，如下所示：

檢測(cè)波長(zhǎng)在小于400nm的紫外光區(qū)，需要用石英比色皿或96孔UV板檢測(cè)；檢測(cè)波長(zhǎng)在大于400nm的可見光區(qū)，玻璃/石英比色皿、96孔板均可檢測(cè)。若最終測(cè)定的反應(yīng)液為有機(jī)試劑時(shí)（丙酮、乙酰乙酯、甲苯、氯仿等有機(jī)試劑），則需使用非聚苯乙烯材質(zhì)的96孔板。

• 樣本選擇

新鮮樣本和冷凍樣本都可用于大多數(shù)指標(biāo)的測(cè)定，但有一些生理活性物質(zhì)容易降解，建議用新鮮樣本測(cè)定，如輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、谷胱甘肽、線粒體復(fù)合體等。

• 樣本處理

動(dòng)植物組織一般使用冰浴勻漿、液氮?jiǎng)驖{或者使用組織破碎儀進(jìn)行勻漿。冰浴勻漿時(shí)注意防止摩擦升溫；液氮研磨時(shí)注意防止反復(fù)凍融并做好防護(hù)。

肝素鋰和EDTA抗凝血漿對(duì)某些酶法項(xiàng)目會(huì)有干擾，溶血、脂血、黃疸樣本會(huì)干擾吸光度法讀數(shù)，嚴(yán)重時(shí)要重采。血清需要及時(shí)分離避免細(xì)胞代謝改變分析物濃度。

細(xì)胞或細(xì)菌樣品收集后，在細(xì)胞或細(xì)菌沉淀中加入一定量的提取液，混勻，將細(xì)胞或細(xì)菌懸浮于提取液中，在冰水浴條件下用超聲破碎儀進(jìn)行破碎。超聲后的細(xì)胞溶液變得透明、清澈，菌液從槍頭滴下不粘連。

土壤樣本建議將鮮土風(fēng)干并過篩后取樣以保證重復(fù)性。風(fēng)干后的土樣在-20℃保存1個(gè)月測(cè)定大部分酶活幾乎不會(huì)有損失，但硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等成分在風(fēng)干過程中會(huì)發(fā)生顯著變化，需用新鮮樣品分析。

• 樣本稀釋與濃縮

樣本測(cè)定值若超出檢測(cè)范圍，可以將提取的上清液用提取液稀釋后重新測(cè)定。一般從高到低，按照2倍，5倍，10倍，20倍的順序，選擇一個(gè)合適的稀釋倍數(shù)。

樣本測(cè)定值若低于檢測(cè)范圍，可以適當(dāng)提高樣本濃度。

• 樣本保存

多數(shù)酶活或含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，采集后建議在-20℃以下低溫保存。提取后的樣本上清液建議當(dāng)天使用完畢，反復(fù)凍融會(huì)影響酶活或含量。

樣本保存過程中要盡可能避免樣品中擬測(cè)定指標(biāo)發(fā)生變化，縮短冷凍時(shí)間。有條件的情況下，樣本取好后立即進(jìn)行液氮速凍。如果不具備條件，也應(yīng)該盡可能縮短樣本進(jìn)入超低溫冰箱的時(shí)間。

冷凍樣本建議在-70℃或者液氮中保存。一般樣本在4℃能保存1周，-20℃保存1個(gè)月，-80℃保存3個(gè)月。制備好的勻漿液建議不要凍存，最好當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定，如放置時(shí)間過長(zhǎng)相關(guān)酶活會(huì)有所下降。

對(duì)于大體積樣本，應(yīng)該把樣本分成小包裝再液氮速凍或者放入超低溫冰箱，避免反復(fù)凍融對(duì)樣本的破壞。

• 儀器校準(zhǔn)、測(cè)定

分光光度計(jì)：預(yù)熱30min，用蒸餾水調(diào)零。

酶標(biāo)儀：選擇正確波長(zhǎng)。

• 加樣與反應(yīng)

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（如需）：嚴(yán)格按說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（避免跳孔）。

加樣順序：建議“空白-標(biāo)準(zhǔn)品-樣本"減少誤差。所有反應(yīng)孔（或比色皿）的加樣順序應(yīng)保持一致，以保證反應(yīng)時(shí)間相同。吸取不同試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭，配制不同組分時(shí)使用不同的儲(chǔ)液器皿，防止交叉污染。

反應(yīng)條件控制：加樣后需充分混勻，確保顯色反應(yīng)。嚴(yán)格按說明書要求控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，注意是否為避光反應(yīng)。

分光光度法與微量法的反應(yīng)體系、試劑濃度、儀器耗材均不同，不可混用或任意改變體系。

• 結(jié)果計(jì)算

生化試劑盒的結(jié)果計(jì)算通常基于特定的檢測(cè)原理（如終點(diǎn)法、速率法等），并通過公式將測(cè)定的吸光度（OD值）或其他信號(hào)值轉(zhuǎn)換為待測(cè)物的濃度或活性。反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)立即測(cè)定，部分試劑盒要求在短時(shí)間內(nèi)完成讀數(shù)，時(shí)間過久會(huì)影響結(jié)果。

• 計(jì)算ΔOD值

終點(diǎn)法：ΔOD=樣本OD-空白OD。

速率法：ΔOD/min=（反應(yīng)末點(diǎn)OD-反應(yīng)起點(diǎn)OD）/反應(yīng)時(shí)間。

• 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（如需要）

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)ΔOD為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

• 樣本濃度計(jì)算

蛋白濃度校正：如需按蛋白濃度計(jì)算，需確認(rèn)提取液是否可用于蛋白濃度測(cè)定；若提取液含蛋白沉淀劑或使蛋白變性，需另取樣本測(cè)定蛋白濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：一般可直接使用試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存使用。

批次一致性：若樣本量過多需分批次實(shí)驗(yàn)，需確保試劑、儀器和操作步驟一致，避免批間誤差。

    驗(yàn)證數(shù)據(jù)：